همونطور که می دونید ما در PCR هدفمون تکثیر یک ناحیه از توالی مد نظر هست. این توالی می تونه از جنس DNA یا RNA باشه. اگر الگوی مورد هدف از جنس DNA باشه که خب مشکلی نداریم. اما در شرایطی که با RNA کار می کنیم، در ابتدا نیاز هست از روی اون یک cDNA سنتز کنیم و بعد cDNA وارد پروسه PCR میشه. در PCR طی هر سیکل توالی دو رشته ای هدف به صورت تصاعدی تکثیر خواهد شد. حالا اگر هدف ما صرفا تکثیر یکی از رشته ها باشه چطور؟ در این قسمت از سری مقالات آموزشی انواع مختلف PCR می خوام در مورد Asymmetric PCR براتون بگم.
Asymmetric PCR چیه؟
تکنیک PCR نامتقارن یا Asymmetric به منظور تکثیر یکی از رشته های DNA هدف، مورد استفاده قرار می گیره. یعنی به جای تکثیر توالی دو رشته ای متقارن، یکی از رشته ها طی پروسه واکنش زنجیره ای پلیمراز بسیار بیشتر از رشته دیگه تکثیر خواهد شد. روند کلی انجام واکنش مثل PCR کلاسیک هست، اما میزان پرایمری که برای رشته هدف طراحی شده و به محیط اضافه میکنیم بیشتر از پرایمر رشته غیرهدف خواهد بود.
در ابتدا به دلیل وجود دو پرایمر، تکثیر دو رشته ای توالی هدف هم اتفاق میوفته. این روند تا زمانی که پرایمر کمتر در محیط وجود داره ادامه پیدا می کنه. اما در ادامه تنها پرایمر مخصوص رشته مورد نظر ما در محیط وجود خواهد داشت. بنابراین از اینجا به بعد صرفا رشته ای از الگو که به عنوان تارگت اصلی هست تکثیر خواهد شد. در این شرایط تکثیر به صورت خطی خواهد بود.
کاربردهای Asymmetric PCR
- توالی یابی
- مطالعات مبتنی بر هیبریداسیون
- مطالعات site-directed mutagenesis
- شناسایی آلل های مختلف
نسبت پرایمرها
نسب مورد استفاده پرایمرها در تکنیک Asymmetric PCR، نیازمند بهینه سازی برای رسیدن به نتیجه مطلوب هست. اما برای شروع میشه نسبت 1:10 رو در نظر گرفت. یعنی پرایمر اختصاصی برای رشته هدف، ۱۰ برابر بیشتر از پرایمر دیگه به محیط اضافه خواهد شد. با توجه به اینکه فرآیند PCR در اکثر موارد نیازمند بهینه سازی هست و اتفاقا یکی از قسمت های بهینه سازی در این آزمایش نسبت جفت پرایمرهاست، برای به دست آوردن حداکثر بازدهی می تونید نسبت یاد شده رو تغییر بدین. مقالات مشابه و پروژه هایی که از این تکنیک استفاده کردن می تونن منبع خوبی برای بررسی نسبت های مختلف جفت پرایمرها در Asymmetric PCR باشن.
پارامترهای دخیل در بهینه سازی Asymmetric PCR
از اونجایی که مراحل کار در این نوع از PCR هم مثل نوع کلاسیک هست، سایر مواردی که در بهینه سازی شرایط کلاسیک دخیل هستن رو هم می شه در اینجا بهینه کرد. از جمله:
- دمای مرحله annealing
- نسبت پرایمرها
- غلظت پرایمرها
- غلظت الگو
- تعداد سیکل های واکنش
دمای مرحله annealing. می تونیم دما رو افزایش بدیم (حتی بیشتر از ۶۵ درجه سانتی گراد). در این حالت شرایط برای تولید توالی های دو رشته ای دشوارتر خواهد شد.
نسبت پرایمرها. همونطور که اشاره شد نسبت پرایمرها رو از 1:10 شروع می کنیم. یکی یکی با شیب افزایشی پیش میریم تا جایی که بهترین بازدهی رو در محصول نهایی مشاهده کنیم.
غلظت پرایمرها. علاوه بر نسبت مورد استفاده، غلظتی از پرایمر که به محیط اضافه می کنیم هم موضوع بسیار مهمی هست و نیاز به بهینه سازی داره. غلظت خیلی زیاد پرایمر سبب ایجاد اتصالات غیر اختصاصی و همچنین تولید دایمر خواهد شد.
غلظت الگو. توجه کنید که اگر غلظت الگو خیلی زیاد باشه، میتونه مشکلاتی از جمله اتصالات غیر اختصاصی رو ایجاد کنه. از اون جایی که غلظت زیاد پرایمر هم می تونه چنین مشکلی رو ایجاد کنه، با توجه به نوع خاص واکنش نباید شرایط رو به نفع تولید محصولات غیر اختصاصی پیش ببریم. کنترل غلظت الگو فاکتور مهمی هست. از اون جایی که بعد از مصرف پرایمر غیر اختصاصی تکثیر به صورت خطی هست، میزان خیلی کم از الگو هم توصیه نمیشه. بنابراین رسیدن به غلظتی از الگو که ما رو به نتیجه دلخواه برسونه فاکتور مهمی در بهینه سازی هست.
تعداد سیکل های واکنش. با توجه به تکثیر خطی در Asymmetric PCR، افزایش تعداد سیکل ها برای رسیدن به حد قابل قبول از محصول نهایی توصیه میشه.
غلبه بر مشکل کمبود ssDNA
با توجه به تکثیر خطی محصول مد نظر، یک مشکل اساسی این هست که بعد از انجام یک دور آزمایش، به تعداد کپی نامبر قابل قبولی دست پیدا نمی کنیم. به همین جهت توصیه میشه محصول PCR رو به عنوان الگویی برای شروع PCR جدید استفاده کنیم. در حقیقت داریم بعد از انجام دور اول آزمایش، Nested PCR انجام میدیم. در این شرایط چون تعداد کپی نامبر قابل توجهی نسبت به شروع واکنش در تیوب آزمایش وجود داره، شروع PCR دوم باعث رسیدن به تعداد کپی نامبرهای بسیار بیشتری از توالی مد نظر خواهد شد.
شاید بگید خب چرا از همون ابتدا تعداد سیکل ها رو خیلی بیشتر در نظر نمیگیریم؟ به این علت که افزایش بیش از حد مجاز سیکل ها، باعث اتمام مواد اولیه واکنش خواهد شد. یعنی از یک جایی به بعد تکثیر صورت نمیگیره. همچنین شانس تولید محصولات غیر اختصاصی هم در چنین شرایطی وجود داره. پس استفاده از توالی های تکثیر شده به عنوان الگویی برای واکنش جدید می تونه به مشکل کمبود ssDNA در دور اول واکنش غلبه کنه.
معایب این تکنیک
- نیاز به افزایش تعداد سیکل ها و در نتیجه زمان بیشتر
- مراحل کاری بیشتر برای رسیدن به بهترین نتیجه
- اختصاصیت پایین در بعضی شرایط (ممکنه پرایمر اصلی اتصالات غیر اختصاصی ایجاد کنه)
- بازدهی پایین در یک دور انجام PCR
جمع بندی
واکنش زنجیره ای پلیمراز نامتقارن، علی رغم معایب و زمان بر بودنش، در بسیاری شرایط با داشتن فضا و امکانات مشابه PCR کلاسیک، می تونه انتخاب مناسبی برای تکثیر یک قطعه توالی تک رشته ای باشه. البته که انجام بهینه سازی های مختلف در اکثر مدل های مختلف PCR دیده میشه. اما از اونجایی که این تکنیک متکی به تکثیر تک رشته ای هست، توصیه می کنم برای طراحی پرایمر خیلی دقت به خرج بدین. اختصاصیت حداکثری پرایمر شما، سبب جلوگیری از هدر رفت ساعت ها وقت و انرژی که برای بهینه سازی صرف کردین، خواهد شد.